Ботаніка - Неведомська Є.О. - 2. Методи цитологічних досліджень

Мікроскопія (від грецьк. mikros - малий та skopeо - спостерігаю) - вивчення під мікроскопом - є основним методом цитологічних досліджень.

Методи дослідження за допомогою світлового (оптичного) мікроскопа (рис. 4) називають світловою мікроскопією. Так можна вивчати загальний план будови клітин та їхні окремі органели, розміром не менше ніж 200 нм. Сучасний світловий мікроскоп забезпечує збільшення об'єктів у 2-3 тис. разів. З його допомогою можна побачити великі органели (мітохондрії, хлоропласти).

1. Об'єктив.

2. Зажими.

3. Предметний столик.

4. Дзеркало.

5. Окуляр.

6. Тубус.

7. Гвинти.

Світлова мікроскопія ґрунтується на тому, що через прозорий чи напівпрозорий об'єкт дослідження проходять промені світла, які згодом потрапляють на систему лінз об'єктива та окуляра. Лінзи візуально збільшують об' єкт дослідження. Кратність збільшення можна визначити як добуток збільшень об' єктива і окуляра.

Клітинні структури дрібніших розмірів (наприклад, рибосоми) відкрито й досліджено за допомогою електронного мікроскопа, винайденого у першій половині ХХ століття. Електронний мікроскоп дає збільшення в сотні тисяч разів (до 500 000 і більше) і дозволяє вивчати ультраструктуру клітин - найдрібніші деталі їхньої будови.

Виготовлення препаратів для світлової та електронної мікроскопії - досить складна процедура. Розглянемо методику одержання тимчасових й постійних препаратів.

Методика одержання тимчасових препаратів під час дослідження будови живих тканин та органів:

1. Виготовлені з допомогою бритви або мікротома поперечні або поздовжні зрізи поміщають на предметне скло в краплину води, вазелінове або силіконове масло, слабкий розчин цукру або в інші рідкі середовища, які не твердіють при висиханні.

2. З метою кращого спостереження компонентів клітини та їх диференціації застосовують прижиттєве забарвлення клітин слабкими розчинами хімічно інертних барвників - метиленового синього, нейтрального червоного та ін.

3. Накривають накривним скельцем.

Тимчасові препарати можна розглядати протягом кількох годин, поки клітини не втратили своєї життєдіяльності.

Розглянемо основні стадії одержання постійних препаратів:

1. Фіксація - зупинка всіх життєвих процесів клітини і збереження її структур. Для цього застосовують швидке охолодження або хімічні фіксатори (спирт, формалін тощо).

2. Об'єкти вивчення вміщують у рідке середовище, яке швидко твердне. Для світлової мікроскопії використовують парафін або целоїдин, а для електронної - пластмаси. Це дозволить зробити з них тонкі зрізи.

3. За допомогою спеціальних пристроїв (мікротомів) роблять тонкі зрізи.

4. Отримані зрізи забарвлюють різними речовинами. Наприклад, для забарвлення ядра, яке містить нуклеїнові кислоти, застосовують барвники з основними властивостями. Зрізи, призначені для електронної мікроскопії, забарвлюють солями важких металів, атоми яких розсіюють електрони.

І в світловому, і в електронному мікроскопах об' єкт розглядається на просвіт. Крізь нього проходить потік світла або електронів. Цей потік заломлюється лінзами. У світловому мікроскопі лінзи скляні, а в електронному - це електромагніти. Конденсор направляє світловий чи електронний потік на об'єкт, а лінзи, розташовані за об'єктом, формують зображення. Зображення розглядають або фотографують.

Крім звичайної мікроскопії у видимих променях використовується також флуоресцентна (люмінесцентна) і ультрафіолетова мікроскопія. При цьому препарати освітлюють синьо-фіолетовими або ультрафіолетовими променями, які зумовлюють свічення (флуоресценцію) багатьох органічних речовин клітини (пігментів, вітамінів, алкалоїдів та ін.). Застосовують також специфічні барвники - флуорохроми, які утворюють флуоресціюючі сполуки з тими речовинами клітин, що не мають здатності до природної флуоресценції. такі флуоресціюючі препарати розглядають в мікроскоп і виявляють розташування і кількість окремих компонентів клітин, такі деталі і тонкощі будови, які не спостерігаються при звичайній мікроскопії. Завдяки флуоресцентній мікроскопії можна досліджувати живі, не зафіксовані або злегка забарвлені клітини в препаратах.

Іншими методами цитологічних досліджень є:

o центрифугування (клітину піддають руйнуванню, а потім розділяють суміш органел у центрифузі при високій швидкості обертання; органели осідають на дно пробірки, розподіляючись шарами відповідно до своєї густини; кожен шар можна виділити й дослідити окремо). Цей метод застосовують для вивчення окремих клітинних структур. 1955 року бельгійський учений Крістіан де Дюв завдяки використанню цього методу відкрив лізосоми, за що йому було присуджено Нобелівську премію;

o метод "мічених атомів", або авторадіографія (у клітину вводять речовину, в якій один з атомів певного хімічного елемента заміщений його радіоактивним ізотопом; за допомогою спеціальних приладів, здатних фіксувати ці ізотопи, можна простежити за міграцією цих речовин у клітині та їхнім перетворенням);

o метод культури клітин (ізольовані живі клітини переносять у стерильне поживне середовище, яке схоже на природне для них середовище; за таких умов клітини здатні розмножуватися і виявляти інші ознаки життєдіяльності; змінюючи середовище, можна вивчати його вплив на клітини). Завдяки цьому методу для дослідження токсичної дії певних речовин не гублять лабораторних тварин. Достатньо скористатися клітинами, вирощеними в культурі. На таких модельних системах можна перевіряти дію лікувальних препаратів, стимуляторів, різних фізичних та інших чинників. Використання культури клітин людини надзвичайно важливе для медичних і біологічних досліджень. Воно може замінити неприпустимі з етичної точки зору експерименти на людях. На основі цього методу розроблено клітинні технології, за допомогою яких конструюються організми із заданими наперед властивостями. Так, із кількох рослинних клітин удається виростити цілу рослину;

o метод прижиттєвого вивчення (досліджують живі клітини, їх процеси життєдіяльності - рух цитоплазми, поділ тощо).